Ассистент кафедры молекулярной биологии и биотехнологии НГУ, инженер Лаборатории белковой инженерии Факультета естественных наук, аспирант 4 курса Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Никита Булгаков проводит анализ взаимодействия критических аминокислотных остатков в активном центре бактериальной эндонуклеазы VIII с основанием напротив повреждения в ДНК. Его проект вошел в число победителей молодежного конкурса научно-исследовательских проектов «Рентгеновские, синхротронные, нейтронные методы междисциплинарных исследований». Проект направлен на изучение пространственной структуры белков и их комплексов с ДНК-субстратами. Полученные данные должны облегчить поиск ингибиторов ферментов, которые в конечном итоге повлияют на решение проблемы антибиотикорезистентности. Данную работу Никита Булгаков выполняет при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования РФ в рамках государственного задания ИК СО РАН (проект FWUR-2024-0040), а также при поддержке Программы «Приоритет—2030».
– ДНК живых организмов, в том числе бактерий, находится под постоянным воздействием экзогенных (внешних) и эндогенных (внутренних) факторов, приводящих к ее повреждению. Одно из самых частых повреждений ДНК – это окисленные азотистые основания. И клетке необходимо исправлять их. Для этого в клетке существуют специальная система эксцизионной репарации оснований. Процесс исправления ДНК многостадийный и мультиферментный. На первом этапе ключевые ферменты — ДНК-гликозилазы — узнают и удаляют поврежденное основание. Мы изучали одну из основных ДНК-гликозилаз бактериальной клетки — эндонуклеазы VIII (Nei), которая узнает и удаляет из ДНК окисленные основания пиримидинового ряда, — объяснил Никита Булгаков.
Чтобы узнать, как влияют разные нокауты генов в E. coli, гены различных белков «включали» по одному, и наблюдали, как это влияло на устойчивость исследуемых бактерий к антибиотикам. Было замечено, что при повышении окислительного стресса, как правило, восприимчивость бактерий к антибиотикам повышается. Когда ген эндонуклеазы VIII нокаутировали, повреждения исправлялись с гораздо меньшей степенью и возрастала восприимчивость бактерии к антибиотикам из макролидного, тетрациклинового, β-лактамного и пептидного рядов, что указывало на потенциальную возможность ингибирования фермента Nei для преодоления проблемы антибиотикорезистентности. Однако ингибиторов активности Nei на данный момент не создано. Их поиск может быть значительно облегчен информацией о пространственной структуре белков и их комплексов с субстратами. Получить данную информацию возможно посредством применения синхротронных источников излучения.
В результате своего исследования Никита Булгаков вырастил ДНК-белковые кристаллы, и а также с использованием синхротронного источника излучения получил рентгеновские дифракционные данные от исследуемых кристаллов. На основе этих данных будет определена кристаллическая структура.
Данная работа дает начало целому циклу работ в области белковой кристаллографии, поскольку с введением в эксплуатацию ЦКП СКИФ будут требоваться сотрудники, обладающие соответствующими компетенциями для работы не только на ЦКП СКИФ, но и с дифракционными данными, полученными на этом синхротроне. Так что в целом этот проект можно назвать стратегическим, поскольку для того, чтобы получить дифракционные данные, не нужно будет обращаться в научные центры, обладающие источниками синхротронного излучения. Будет возможность проводить такие исследования, не выезжая из Новосибирска.
— Информация о белках, которые были закристаллизованы и кристаллические структуры которых уже определены, внесена в специальную базу данных Protein Data Bank (www.rcsb.org). Там представлена лишь одна структура комплекса Nei с ДНК. В ней достаточно хорошо разрешен активный центр, но не отражается весь спектр конформаций фермента, поскольку напротив повреждения в ней находится аденин. Из кинетических данных известно, что Nei хуже всего удаляет повреждения именно напротив аденина. Между тем, для более адекватного понимания механизма действия этого фермента и разработки его эффективных ингибиторов необходима информация о структуре комплексов Nei с ДНК, содержащей другие основания напротив повреждения. Поэтому мне нужно было получить кристаллические структуры конъюгатов Nei E. coli с ДНК-дуплексами с основаниями G, C и T (гуанин, цитозин и тимин) напротив повреждения, — рассказал Никита Булгаков.
Вместе со своим научным руководителем ассистентом кафедры молекулярной биологии и биотехнологии НГУ, инженером Лаборатории белковой инженерии Факультета естественных наук НГУ Анной Юдкиной Никита Булгаков наработал и выделил с помощью ионообменной и аффинной хроматографий свободный фермент, затем создал белковые конъюгаты с ДНК посредством боргидридной сшивки, которые очистил с помощью ионообменной хроматографии, а далее уже занялся поиском кристаллизационных условий для этих конъюгатов. Сбор дифракционных данных проводился совместно с учеными Центра исследований молекулярных механизмов старения и возрастных заболеваний МФТИ, которые имеют доступ к ресурсам Шанхайского центра синхротронного излучения (КНР).
На этапескрининга условий кристаллизации конъюгатов использовались и уже известные условия кристаллизации для подобного конъюгата. Скрининг новых условий проводился из-за того, что препараты новых ДНК-белковых конъюгатов могли содержать примесные белки, которые не детектировались стандартными методами, но могли влиять на рост кристаллов целевого соединения.
— Скрининг условий представляет собой очень трудоемкий процесс, при котором используются кристаллизационные планшеты, в которых содержится по 96 лунок, в каждой из которых можно задать по 3 соотношения «белковый препарат:осадитель» (скрининговый раствор) для выращивания белковых кристаллов при разных условиях. Мы использовали 5 таких планшетов. В результате были выращены кристаллы и в оптимизационных, то есть в известных, условиях, и в скрининговых. Это удовлетворительный результат, так как при нашем исследовании важно получить как можно большее количество кристаллов, поскольку до синхротрона доедут не все кристаллы, или же часть кристаллов окажется не белковыми. Следующий этап нашей работы — съемка данных на синхротроне. Коллеги из МФТИ, которые имеют доступ к ресурсам Шанхайского центра синхротронного излучения (КНР), помогли нам с этим этапом, так что теперь у нас есть рентгеновские дифракционные данные, на основе которых будут получены кристаллические структуры конъюгатов для дальнейшего анализа активного центра фермента.
С введением в эксплуатацию ЦКП СКИФ получение дифракционных данных станет существенно проще, поскольку теперь можно будет после получения белковых кристаллов использовать мощности сибирского источника синхротронного излучения, который находится достаточно близко к Академгородку, — пояснил Никита Булгаков.
После получения дифракционных данных с высоким разрешением исследователи перешли к определению трехмерной структуры соответствующего ДНК-белкового конъюгата для анализа его активного центра. В ходе этой работы они смогут с большой точностью определить механизм реакции удаления окисленного основания в зависимости от основания напротив, разрабатывать ингибиторы для некорректной работы Nei внутри бактериальной клетки, что позволит снизить антибиотикорезистентность.
